Proteases e quitinases de fungos anamórficos de insetos da Amazônia com uso potencial em biocontrole - Barroncas, Jéssica Ferreira (Universidade Federal do Amazonas, 2013)
Enzimas hidrolíticas são utilizadas em diversos ramos da indústria e da biotecnologia, dentre elas, as proteases e as quitinases. Estas enzimas são secretadas por fungos que causam patologias em diversos organismos, representando um importante fator de virulência para os mesmos. O objetivo deste trabalho foi isolar fungos de percevejo de renda (Vatiga illudens) e cochonilha (Orthezia sp.), avaliar o potencial proteolítico dos extratos dos isolados, determinar a temperatura e pH ótimo da enzima, bem como realizar a purificação parcial de proteases e quitinases produzidas. Para isolamento de fungos os insetos foram colocados em câmara úmida a 25 º C, seguido do cultivo em ágar Sabouraud. Os fungos foram submetidos à fermentação submersa em meio MGYP. O extrato bruto foi recuperado por filtração a vácuo e inoculado em cup-plate, em meio sólido com caseína 10% (p/v) a 37 ° C. O efeito da temperatura e do pH sobre a atividade proteolítica foi determinada usando azocaseína 1% (p/v) como substrato, em diferentes tampões de pH (5-10) e temperaturas (25 ° C-60 ° C). Cinco isolados fúngicos foram selecionados a partir dos obtidos de Vatiga illudens e de Orthezia sp. Os extratos selecionados foram submetidos à purificação parcial das proteínas por fracionamento com sulfato de amônio nas frações 0-60% e 60-80% de saturação. Após diálise, foram determinadas concentração protéica, atividade proteolítica, atividade quitinolítica, atividade específica, rendimento e fator de purificação de cada uma das frações e dos extratos brutos. De V. illudens, foram identificados os fungos: Paecilomyces sp. e P. javanicus. A maior diversidade de fungos foi encontrada em Orthezia sp., representado por Fusarium decemcellulare, Penicillium aurantiogriseum, P. brevicompactum, P. fellutanum, P. glabrum e P. solitum. Os ascomicetos foram Eupenicillium javanicum. Os isolados formaram halos de 10-19 mm de diâmetro em meio sólido e o extrato bruto expressou atividade proteolítica variando entre 1,40-27,07 U/mL. A atividade enzimática da temperatura e pH ótimo variou entre os isolados. Na fração F2 (60-80%) foram registradas as maiores atividades específicas tanto de protease quanto de quitinase. Nos extratos semipurificados de P. brevicompactum (C3) e P. fellutanum (C1) foram observadas as maiores atividades específicas de protease (18,72 U/mg) e quitinase (0,88 μg/mg), respectivamente.