Caracterização estrutural da BpirSP-39 e isolamento e caracterização da primeira serinoprotease do veneno da serpente Bothrops brazili - Zaqueo, Kayena Delaix (Universidade Federal do Amazonas - Universidade Federal de Rondônia, 2017)
Os venenos de serpentes são constituídos por compostos orgânicos e inorgânicos, resultando em um produto biológico eficiente e de natureza complexa, que tem como principais objetivos a imobilização, morte e a promoção da digestão inicial das presas. Além disso, apresentam um enorme potencial para prospecção de moléculas com aplicação farmacológica. Dentre os compostos orgânicos destacam-se as proteínas, principalmente as proteases, pois apresentam capacidade em alterar o sistema hemostático. As serinoproteases dos venenos de serpentes (SVSPs) pertencem à classe de proteases que agem sobre diferentes fatores da cascata de coagulação. Uma das classes de SVSPs é descrita como trombina-símile (SVTLEs) por mimetizar algumas atividades da trombina, exibindo capacidade coagulante in vitro por intermédio da degradação das cadeias α e/ou β do fibrinogênio. Os objetivos do trabalho foram (i) caracterizar estruturalmente a BpirSP-39 isolada previamente do veneno de Bothrops pirajai e (ii) isolar e caracterizar a primeira serinoprotease (SP) do veneno de B. brazili. Estudos dessa magnitude justificam-se, pois podem trazer importantes informações sobre a participação das proteínas durante o envenenamento, podendo auxiliar no melhor conhecimento sobre os mecanismos de ações destas enzimas. As estruturas primárias, bem como, os modelos tridimensionais de ambas SPs isoladas foram elucidados. A BpirSP-39 possui 224 aminoácidos e apresenta elevada identidade com outras SVSPs. A BbrzSP-32 foi obtida do veneno de B. brazili após duas etapas cromatográficas (afinidade e fase reversa) e sua estrutura primária apresentou 240 resíduos de aminoácidos. Ambas as enzimas caracterizadas podem assumir a estrutura da SP de Agkistrodon halys (PDB ID: 4E7N), proteína utilizada como modelo para a modelagem molecular, sendo glicoproteínas monoméricas globulares com duas α- hélices e dois barris formados por folhas-β. Com relação à BbrzSP-32, por intermédio de eletroforese foi obtida a massa molecular relativa (36 kDa), sendo sua massa absoluta confirmada por espectrometria de massa como 32.520 Da. A BbrzSP-32 possui identidade de até 79,48% quando comparada a outras SVSPs e foi capaz de, em modelos in vitro, degradar a cadeia α do fibrinogênio, sendo considerada uma SVTLE11 A. Possui atividade dose dependente no processo de degradação de redes de fibrina, demonstrando maior especificidade por essa atividade quando comparada à sua ação trombolítica. Apresenta atividade de proteólise sobre gelatina e substratos cromogênicos, para serinoproteases e enzimas trombina-símile (S-2288 e S-2238, respectivamente), além de possuir atividade coagulante sobre o plasma humano. As atividades de proteólise sobre os substratos S-2288 e S-2238, bem como, coagulantes, foram reduzidas por PMSF e benzamidina e, em menor proporção por EDTA. A BbrzSP-32 apresenta relativa estabilidade frente a variações de pH e temperatura, demonstrando maiores atividades entre 30 e 40 ºC e, em intervalo de pH 7,5 à 8,5. A enzima não induz ou interfere na coagulação de plaquetas lavadas. Quando incubada com os parasitos Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum, nas formas epimastigota e promastigota, respectivamente, e bactérias gram-positiva da espécie Staphylococcus epidermidis, apresentou-se citotóxica sobre os microrganismos, além disso, foi capaz de reduzir o biofilme formado pela espécie de bactéria. Ambas SPs apresentam potenciais biotecnológicos.