Clonagem e expressão da enzima beta-glucosidase recombinante do fungo Aspergillus niger em Pichia pastoris - Rabelo, Sandro Ferreira (Universidade Federal do Amazonas, 2019)
As enzimas celulolíticas são produzidas por uma diversidade de microrganismos. Contudo, a grande maioria apresenta grandes restrições que dificultam ou que oneram o processo de produção das enzimas. Além disso, grande parte dos consórcios enzimáticos comerciais disponíveis, apesar de apresentarem os três grupos de celulases (Endoglucanases, Celobiohidrolase, β-glucosidase) para a completa degradação da celulose, possuem uma baixa atividade β-glucosidásica. Deste modo, gera necessidade de suplementação desta enzima a estes preparados enzimáticos. Para resolver estas restrições, a biologia molecular aliada à tecnologia do DNA recombinante se configura como uma ferramenta favorável na produção enzimática, viabilizando a expressão apenas das enzimas de interesse, minimizando ou eliminando a produção de proteínas interferentes. Neste contexto, a produção de β-glucosidase recombinante por microrganismo geneticamente modificado Pichia pastoris, se configura como um grande passo para obtenção dessa enzima com uma produção economicamente viável e com grande potencial para aplicação na industrial. Portanto, β-glucosidases recombinantes são potenciais ferramentas na produção de bioetanol, e no futuro próximo, pode ser bem-sucedida no cumprimento dos requisitos de fontes alternativas e renováveis de energia. De acordo com a crescente importância da β-glucosidase em diversas aplicações, o presente trabalho teve como objetivo clonar e expressar a enzima β-glucosidase recombinante de Aspergillus niger na levedura metilotrófica P. pastoris. Conforme os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima β-glucosidase de A. niger foi expressa eficientemente na levedura P. pastoris, assim como, a sua secreção no sobrenadante da cultura celular conforme análise de imunodetecção Colony Blotting. Baseado no perfil eletroforético em gel SDS-PAGE dos tempos de indução da produção de β-glucosidase dos clones recombinantes Mut+ (46) e clone Muts (22), a indução em meio liquido dos clones recombinantes foi realizada com sucesso devido à apresentação da banda correspondente a enzima β- glucosidase com massa molecular de aproximadamente 103 kDa. No clone Mut+ o melhor tempo de indução para expressão da proteína recombinante foi o tempo de 72 horas, no clone Muts os melhores tempos foram 72 horas e 96 horas. Portanto, a atividade β-glucosidásica do clone recombinante Muts foi de 12.517,33 U. L-1.