Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator - Pinto, Elson Antônio Sadalla (Universidade Federal do Amazonas, 2019)
A expressão heteróloga do hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (rtGH), Colossoma macropomum, na levedura metilotrófica Pichia pastoris aponta a perspectiva de geração de um produto biotecnológico inovador para a piscicultura brasileira, em especial para o cultivo do tambaqui. Nessa perspectiva, esta pesquisa teve por objetivo avaliar o potencial de expressão do rtGH na levedura P. pastoris, em sistema de frascos agitados e em biorreator. Inicialmente foi realizada uma seleção dos clones transformantes de P. pastoris com capacidade de produzir os melhores níveis de rtGH, levendo em consideração o fenótipo. Para melhorar o nível de expressão do rtGH em sistema de frascos agitados, foram utilizadas as ferramentas estatísticas de planejamento experimental fatorial. Primeiramente, um screening design baseado no delineamento Plackett e Burman foi utilizado para seleção dos parâmetros mais significativos relacionados à produção de rtGH e biomassa: extrato de levedura, peptona, ureia, tampão fosfato, biotina, metanol, inóculo e pH. Posteriormente, os parâmetros selecionados, metanol e peptona, foram avaliados em DCCR e analisados por meio da metodologia de superfície de resposta. Por fim, foi realizada uma fermentação conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol e o perfil cinético de produção do rtGH determinado. Os resultados obtidos indicaram o clone 32b, fenótipo Mut+, como o mais produtivo. O metanol foi apontado como o parâmetro mais importante para a produção do rtGH, seguido da peptona, biotina e inóculo. Em relação à formação de biomassa, o metanol, extrato de levedura e tampão fosfato foram os parâmetros mais importantes. De acordo com o modelo obtido, as concentrações de 1,55 % de metanol e 2,8% de peptona foram consideradas ótimas para produção do rtGH. O modelo foi validado com aumento da produção de rtGH de 0,3 mg/L para 2,4 mg/L na condição otimizada. A fermentação em biorreator, conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol, resultou num nível de produção de rtGH de 250 mg/L, aproximadamente 100 vezes superior ao obtido em frascos agitados. Esta pesquisa foi pioneira no desenvolvimento de estratégias de otimização da produção do rtGH em P. pastoris utilizando frascos agitados e biorreator.