Clonagem, expressão e caracterização de lisozima de Anopheles darlingi em Pichia pastoris - Silva, Samanta Gabriela Souza da (Universidade Federal do Amazonas, 2019)
Desde a sua descoberta em 1922 por Alexander Fleming, a lisozima tornou-se um dos modelos enzimáticos mais estudados, devido ao seu mecanismo de ação como barreira natural de defesa contra microrganismos, especialmente bactérias gram-positivas. Na natureza, a lisozima é dividida em 6 tipos: tipo C, tipo G, tipo I, fúngico e bacteriano, fagos e plantas com características diferenciadas. Esta pesquisa tem como objetivo clonar e expressar a lisozima de Anopheles darlingi na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para este fim, uma cassete de expressão foi montado para inserção do gene da lisozima sintética de Anopheles darlingi no genoma da Pichia pastoris usando o vector de expressão pPIC9, confirmado por análise de restrição com as enzimas EcoRI e NotI. O cassete de expressão foi introduzida em P. pastoris por eletroporação, e 40 clones resultantes da transformação foram selecionados em meio mínimo sem aminoácidos. A técnica de imunodetecção cromogênica Western Breeze confirmou 39 clones recombinantes produtores de lisozima detectando a cauda de histidina presente na porção C-terminal no gene da lisozima. O uso do promotor AOX1 na cassete de expressão permitiu a indução dos clones recombinantes com metanol a 1% por 96 horas em fermentação submersa e a confirmação da expressão da proteína foi realizada pela análise eletroforética em gel de poliacrilamida em condição desnaturante SDS-PAGE 15% onde a presença da lisozima foi detectada em aproximadamente 14 kDa. A caracterização da enzima mostrou que a lisozima de A. darlingi possui aspectos distintos em relação a lisozima do ovo de galinha. Os resultados obtidos demonstram a capacidade que a levedura Pichia pastoris possui de expressar a lisozima e demonstram a agregação de potencial biotecnológico a esta pesquisa.