Clonagem, expressão e caracterização enzimática de lipase recombinante em Pichia pastoris - Vieira, Andre da Fonseca (Universidade Federal do Amazonas, 2019)
As triacilglicerol lipases, (E.C.3.1.1.3), usualmente chamadas de lipases, catalisam reações de ésteres carboxílicos em triacilglicerol formando ácidos graxos livres, possuem a característica de exercer atividade catalítica em meio aquoso de hidrólise. Fora do meio aquoso, ocorrem reações, de esterificação, interesterificação ou transesterificação. Devido ao grande potencial biotecnológico, as enzimas lipolíticas tem ganhado enorme destaque para uso industrial devido ao seu abrangente leque de aplicações, constituindo um dos grupos de maior importância em biocatálise, favosrescendo maior eficácia no processo. Justifica-se o estudo de novas moléculas com alto potencial biotecnológico para suprir novas necessidades do mercado mundial, especialmente as que provém da Amazônia, região ímpar em diversidade biológica. Com o objetivo de caracterizar enzimaticamente uma lipase recombinante expressa em Pichia pastoris, o gene codificador de lipase foi isolado de uma biblioteca metagenômica de terra preta de índio por PCR e integrado no genoma da levedura P. pastoris no vetor de expressão pPIC9. A transformação ocorreu por eletroporação com 10 µg do cassete de expressão linearizado e clones foram selecionados em meio minimo em aminoácidos. A seleção de clones recombinantes ocorreu em BMMY sólido contendo 1% de tributirina em meio BMMY com clones positivos cultivados em fermentação submersa induzida com metanol 0,5% para a produção de lipase. A região estrutural do gene de lipase foi amplifica com aproximadamente 1200 pb. Foram observados halos de degradação aos redores das colônias. Averiguou-se a presença da enzima com 50 kDa no gel de SDS PAGE. A caracterização enzimática foi último passo para verificar as possibilidades biotecnológicas desta lipase por meio de ensaios colorimétricos, que resultou positivamente para atividade enzimática de 50,80 U/mL temperatura ótima de 50°C e pH de 7 sendo o melhor tempo de reação de 5 minutos