Purificação, caracterização e quantificação de celulases produzidas por bactérias, depositadas na coleção bacteriológica do Laboratório de Microbiologia - UFAM - Rafael Menezes Valente (Universidade Federal do Amazonas, 2016)
As enzimas são catalisadores biológicos, constituídas de proteínas produzidas por células vivas que apresentam alta atividade e seletividade específica sobre o substrato. O mercado de celulases ganhou impulso no início do século XXI quando houve grandes investimentos na produção de celulases, especialmente focada para sua aplicação na obtenção de biocombustível. Novozymes e Genencor, liberaram um montante de US$ 17,1 milhões com a meta de reduzir em 10 vezes o custo efetivo das celulases. Esta meta foi superada já em 2004 com uma redução de 12 vezes no custo da enzima. O mercado brasileiro de celulases é estimado em cerca de US$ 30 a 130 milhões até 2015 e de US$ 290 a 380 milhões para 2020. A Amazônia é formada por uma das maiores reservas de biomassa celulósica do mundo e seus solos são muito ricos em matéria orgânica constituindo um excelente habitat microbiano, principalmente para as bactérias. As bactérias serão reativadas e confirmadas às identificações em nível de gênero. Para o teste da atividade enzimática do extrato bruto, serão preparados meios com Agar bacteriológico (1,8%), carboximetilcelulose (1%) e água destilada (100 mL). A quantificação da produção de celulase via açúcares redutores será realizada utilizado o método de Miller (1959). Para quantificação da produção de açúcares redutores será utilizada uma curva de calibração tendo como base a solução-estoque de 2,5g/dL de glicose. Serão preparados em tubos contendo 0,5 mL do extrato bruto, 1,5 mL de água deionizada e 3 mL de DNS. Após aquecidas e resfriadas, as amostras serão analisadas a 540 nm em espectrofotômetro. Para determinar o efeito da temperatura na atividade das celulases, será utilizado meio Agar celulose 0,5% (p/v), pH de 7,0 utilizando o extrato bruto (item 3.3) nas temperaturas 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC. Para determinar o efeito do pH na atividade da celulase, será utilizado o extrato bruto (item 3.3) em meio Agar celulose 0,5% (p/v), em pH 4,0 e 5,0 utilizando tampão citrato-fosfato (50 mM) e para os valores 6,0; 7,0 e 8,0 será utilizado o tampão fosfato (50 mM). Após a verificação da influência de diferentes variáveis independentes na produção de celulases, será selecionada a bactéria que apresentar maior quantificação na produção da enzima. As condições de cultivo em planejamento fatorial serão realizadas em Solução de Manachini {(2,0 g.L-1 de KH2PO4; 1,0 g.L-1 de (NH4)2SO4; 0,1 g.L-1 MgSO4.7H2O; 0,9 g.L-1 de Na2HPO4.2H2O e água destilada, 1000 mL)} em diferentes concentrações de CMC (0,1; 0,25 e 1,0% p/v); amido (0,0; 0,5 e 1,0% p/v), e uréia (0,0; 0,5 e 1,0% p/v), serão avaliadas de acordo com planejamento experimental completo (23) com 4 repetições no ponto central. Os experimentos para extração das enzimas foram realizados com solução de Polietileno Glicol (50% p/v) de diferentes massas molares, PEG 400, 4000 e 6000 e soluções de fosfato (40%), consistindo de uma mistura de quantidades adequadas de KH2PO4 e K2HPO4, em pH 7,0; 8,0 e 9,0.