Método baseado me cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a atividade dos transportadores de GABA no sistema nervoso central

MORAES, Edinaldo Rogério da Silva

Tese

Método baseado me cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a atividade dos transportadores de GABA no sistema nervoso central

The GATs are the membrane proteins responsible for the uptake of GABA in the central nervous system. Alterations in GAT activity are implicated in several neurological diseases, including retinopathies. The present study describes an alternative method to determine GAT activity in tissue preparation...

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Autor principal:	MORAES, Edinaldo Rogério da Silva
Grau:	Tese
Idioma:	por
Publicado em:	Universidade Federal do Pará 2025
Assuntos:	Acido gama-aminobutírico Neurotransmissores Doenças retinianas Cromatografia líquida de alta pressão Inibidores de captação GABA Proteínas da membrana plasmática de transporte GABA Transportador GAT-1 Transportador GAT-2 Transportador GAT-3 Transportador GAT-4 CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FISIOLOGIA NEUROFISIOLOGIA NEUROCIÊNCIAS
Acesso em linha:	https://repositorio.ufpa.br/jspui/handle/2011/16925

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spelling	ir-2011-169252025-03-21T15:23:19Z Método baseado me cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a atividade dos transportadores de GABA no sistema nervoso central MORAES, Edinaldo Rogério da Silva SILVA, Anderson Manoel Herculano Oliveira da http://lattes.cnpq.br/8407177208423247 Acido gama-aminobutírico Neurotransmissores Doenças retinianas Cromatografia líquida de alta pressão Inibidores de captação GABA Proteínas da membrana plasmática de transporte GABA Transportador GAT-1 Transportador GAT-2 Transportador GAT-3 Transportador GAT-4 CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FISIOLOGIA NEUROFISIOLOGIA NEUROCIÊNCIAS The GATs are the membrane proteins responsible for the uptake of GABA in the central nervous system. Alterations in GAT activity are implicated in several neurological diseases, including retinopathies. The present study describes an alternative method to determine GAT activity in tissue preparations of the central nervous system, using high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. The GABA concentration in the medium was determined using the o-phthaldehyde (OPA)-derivation protocol validated by the Brazilian Health Regulatory Agency (ANVISA) and the United States Food and Drug Administration (US-FDA). The GAT activity in the retinal preparations was determined through the evaluation of the GABA uptake, which was measured by assessing the difference between the initial and final concentrations of GABA in the incubation médium (Δ𝐺𝑎𝑏𝑎 = [𝐺𝑎𝑏𝑎] 𝑡_0 − [𝐺𝑎𝑏𝑎] 𝑡_𝑒𝑛𝑑). The evaluation of the GAT kinetics returned values of Km = 382.5 ± 32.2 μM and Vmax = 34 nmol/mg of protein. The data also demonstrated that the GABA uptake was predominantly Na+ and temperature-dependent, and was also inhibited by incubation with nipecotic acid, a substrate of GABA transporters. Taken together, these findings confirm that our approach provided a specific measure of GAT activity in retinal tissue. The data presented here thus validate, for the first time, an alternative, simple and sensitive method for the evaluation of GAT activity using high performance chromatography on preparations of the central nervous system. Os GATs são os principais transportadores de GABA no sistema nervoso central e alterações em sua atividade estão envolvidas em várias doenças neurológicas, incluindo retinopatias. O presente estudo descreve um método eficiente utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção por fluorescência para determinação da atividade dos GATs em preparações de retina. Explants de retina foram incubadas em concentrações conhecidas de GABA (50-1000 μM) por 30 minutos, e os níveis do neurotransmissor derivado de o-ftaldeído (OPA) no meio de incubação foram mensurados. Ao avaliar a diferença entre as concentrações inicial e final de GABA no meio ( Δ𝐺𝑎𝑏𝑎 = [𝐺𝑎𝑏𝑎] 𝑡_0 − [𝐺𝑎𝑏𝑎] 𝑡_𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙), um mecanismo de captação saturável foi caracterizado ( Km e Vmáx de 382,4 μM e 34 nmol/mg proteína/minuto, respectivamente). Tal mecanismo foi amplamente dependente do Na+ e de temperatura, reiterando que o mecanismo de diminuição da concentração é de fato captado por transportadores de alta afinidade. Somado a isso, nossos resultados também demonstraram que o ácido nipecótico (um substrato dos transportadores GAT) inibiu a captação de GABA em preparações retinianas, demonstrando uma elevada especificidade dessa metodologia. No geral, o presente estudo caracteriza um método alternativo e altamente sensível para avaliar a atividade do GAT no SNC. UEPA - Universidade do Estado do Pará 2025-02-26T16:09:56Z 2025-02-26T16:09:56Z 2022-08 Tese MORAES, Edinaldo Rogério da Silva. Método baseado em cromatografia líquida de alta eficiência para analisar a atividade dos transportadores de GABA no sistema nervoso central. Orientador: Anderson Manoel Herculano. 2022. 96 f. Tese (Mestrado em Neurociências Biologia Celular) - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2025. Disponível em: https://repositorio.ufpa.br/jspui/handle/2011/16925. Acesso em:. https://repositorio.ufpa.br/jspui/handle/2011/16925 por Acesso Aberto Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ application/pdf Universidade Federal do Pará Brasil Instituto de Ciências Biológicas UFPA Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular Disponível na internet via correio eletrônico: biblicb.420@gmail.com
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