Tese

Purificação parcial e caracterização da enzima xilanase produzida pelo fungo amazônico Pycnoporus sanguineus l. F. (murr)

Pycnoporus sanguineus são excelentes degradadores de matéria orgânica, apresentando importante papel em seu habitat. No presente trabalho, uma linhagem de Pycnoporus sanguineus isolada do solo de área rural do Município de Parintins, Amazonas, Brasil, foi cultivada em meio sólido de malte, a 350C, p...

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Autor principal: Carmo, Cynara da Cruz
Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/5843265491876998
Grau: Tese
Idioma: por
Publicado em: Universidade Federal do Amazonas 2015
Assuntos:
Pycnoporus sanguineus
Enzimas hidrolíticas
Xilanase
Pycnoporus sanguineus
Hydrolytic enzymes
Xylanase
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Acesso em linha: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/4364
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spelling oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-43642016-06-10T12:53:35Z Purificação parcial e caracterização da enzima xilanase produzida pelo fungo amazônico Pycnoporus sanguineus l. F. (murr) Carmo, Cynara da Cruz Silva, Leonor Alves de Oliveira da http://lattes.cnpq.br/5843265491876998 http://lattes.cnpq.br/0266531460880375 Carvalho, Sônia Maria da Silva Camarão, Helena T. Pycnoporus sanguineus Enzimas hidrolíticas Xilanase Pycnoporus sanguineus Hydrolytic enzymes Xylanase CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Pycnoporus sanguineus são excelentes degradadores de matéria orgânica, apresentando importante papel em seu habitat. No presente trabalho, uma linhagem de Pycnoporus sanguineus isolada do solo de área rural do Município de Parintins, Amazonas, Brasil, foi cultivada em meio sólido de malte, a 350C, por 8 dias, para obtenção da cultura pura e meio líquido de malte acrescido de 2% de glicose e 120 rpm por um período de 10 dias para produção das enzimas xilanase, β-xilosidase, β-glicosidase, CMCase, avicelase e lacase. Entre essas enzimas, a produção de xilanase foi avaliada e a enzima foi parcialmente purificada e caracterizada. Produção ótima foi obtida em pH 6,5 a 35 °C, 120 rpm e 196h de cultivo. O filtrado de cultura (200 mL), obtido nas condições otimizadas nas etapas anteriores, foi precipitado a 70% de sulfato de amônia e centrifugado por 60 minutos a 40C e rotação de 4 000 rpm. Um mL da fração precipitada na qual detectou-se atividade xilanolítica, foi filtrado utilizando um filtro Millex GV 0,22μm (durapore PYDF Membrane) e posteriormente injetada em um cromatógrafo tipo AKTA Purifier UPC 900, sistema UNICORN 5.11; utilizando uma coluna de troca aniônica HiTrap SP XL, capacidade 1mL, previamente equilibrada no tampão Tris-HCl 50mM pH 7,4. O índice de pureza, das frações que apresentaram atividade xilanase, bem como seus perfis protéicos, foram analisadas eletroforeticamente em PAGE-SDS (12% de poliacrilamida), onde a massa molar determinada foi de 39,44 kDa. As condições ótimas para atividade da enzima foram 75 °C e pH 8,0. A estabilidade térmica da enzima xilanase de P. sanguineus parcialmente purificada foi alta de 65 a 85ºC, sendo mais estável a 750C. A estabilidade em diferentes pHs foi alta entre 4,5 e 8,8. Com xilano de birchwood (2,0 a 50 mg/mL), o valor de Km da enzima foi de 0,32786 mg/ml, e o valor de Vmax foi de 12,70648 μmol min-1 mL-1 quando a reação foi realizada a 75ºC e pH 8,0. Esses resultados indicam o possível emprego desse complexo enzimático em processos industriais que requeiram o uso de xilanases em pH alcalino e alta estabilidade em diferentes pHs e altas temperaturas. Pycnoporus sanguineus are excellent decomposers of organic matter, presenting important role in its habitat. In this study, a strain of Pycnoporus sanguineus isolated from soil of rural area of Parintins, Amazonas, Brazil, was grown on solid medium of malt, 35 0C for 8 days to obtain a pure culture and malt liquid medium plus 2% glucose and 120 rpm for a period of 10 days to produce the enzyme xylanase, β-xylosidases, β-glucosidase, CMCase, and laccase avicelase. Among these enzymes, the production of xylanase was evaluated and the enzyme was partially purified and characterized. Optimum yield was obtained at pH 6.5 at 35 °C, 120 rpm and 196h of cultivation. The culture filtrate (200 mL), obtained under the conditions optimized in the previous steps, was precipitated at 70% ammonium sulfate and centrifuged for 60 min at 4 0C and rotation of 4000 rpm. One mL of the fraction precipitated in which xylanolytic activity was detected, was filtered using a filter Millex GV 0.22 micrometre (Durapore Membrane PYDF) and subsequently injected into a chromatograph type AKTA Purifier UPC 900, 5:11 UNICORN system, using an anion exchange column HiTrap SP XL 1 mL capacity, equilibrated in 50 mM Tris-HCl pH 7.4. The degree of purity, the fractions that showed xylanase activity, as well as their protein profiles were analyzed by electrophoresis on SDS-PAGE (12% polyacrylamide), where the molar mass of 39.44 kDa was determined. The optimal conditions for enzyme activity were 75 °C and pH 8.0. The thermal stability of the xylanase enzyme from P. sanguineus was partially purified high 65 to 85 ºC, being more stable 75 0C. The stability at different pHs was high between 4.5 and 8.8. With birchwood xylan (2.0 to 50 mg / mL), the Km value of the enzyme was 0.32786 mg / ml, and the Vmax value was 12.70648 mol min-1 mL-1 when the reaction was performed at 75 °C and pH 8.0. These results indicate the possible use of this enzyme complex industrial processes that require the use of xylanases at alkaline pH and high stability in different pHs and high temperatures. CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2015-07-10T20:19:36Z 2011-09-28 Tese CAMO, Cynara da Cruz. Purificação parcial e caracterização da enzima xilanase produzida pelo fungo amazônico Pycnoporus sanguineus l. F. (murr). 2011. 73f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2011. http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/4364 por Acesso Aberto application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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