A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora
natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp-
Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma
ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a
remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de
proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular
resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a
expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de
clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência
codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de
aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi
subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o
plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é
regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de
E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor
crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era
induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em
meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células
de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do
tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de
filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle.
Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas
de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína
ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração
insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos
níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a
funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.
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