Dissertação

Expressão heteróloga da enteroquinase em enzima Escherichia coli

A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp- Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comument...

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Autor principal: Pinto, Kerollen Runa
Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/9963306999262287
Grau: Dissertação
Idioma: por
Publicado em: Universidade Federal do Amazonas 2018
Assuntos:
Enteroquinase
Promotor TH2
Expressão heteróloga
Enterokinase
TH2 promoter
heterologous expression
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Acesso em linha: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6783
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Por meio do processo de clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle. Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02. Enterokinase (EC 3.4.21.9) is a heterodimer serine protease, a natural activator of trypsinogen, capable of cleaving specifically the sequence Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. Due to the high specificity of the recognition site, it became a great tool of biotechnological interest. It is usually used to remove affinity tags in vitro, of recombinant proteins. In this work, the molecular cloning strategy resulted in the construction of the pDMK06, capable of programming the regulated expression of a heterologous gene ETK-Trx in E. coli. Through the cleavage process with restriction enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately 1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06, when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology, characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx, polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction, probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02 plasmid expression/regulation system. FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas Período de Embargo: 13/11/2018 - 28/02/2021 2018-11-28T13:20:12Z 2017-02-27 Dissertação PINTO, Kerollen Runa. Expressão heteróloga da enteroquinase em enzima Escherichia coli. 2017.82 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2017. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6783 por Acesso Aberto http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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