Clonagem e expressão da enzima beta-glucosidase recombinante do fungo Aspergillus niger em Pichia pastoris
As enzimas celulolíticas são produzidas por uma diversidade de microrganismos. Contudo, a grande maioria apresenta grandes restrições que dificultam ou que oneram o processo de produção das enzimas. Além disso, grande parte dos consórcios enzimáticos comerciais disponíveis, apesar de apresentarem os...
| Autor principal: | Rabelo, Sandro Ferreira |
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| Outros Autores: | http://lattes.cnpq.br/2577154584136677 |
| Grau: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Publicado em: |
Universidade Federal do Amazonas
2019
|
| Assuntos: | |
| Acesso em linha: |
https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6959 |
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oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-69592019-08-21T19:37:01Z Clonagem e expressão da enzima beta-glucosidase recombinante do fungo Aspergillus niger em Pichia pastoris Cloning and expression of the recombinant beta-glucosidase enzyme of the fungus Aspergillus niger in Pichia pastoris Rabelo, Sandro Ferreira Andrade, Edmar Vaz de http://lattes.cnpq.br/2577154584136677 http://lattes.cnpq.br/4691893433367918 Oliveira, Hugo Valério Corrêa de http://lattes.cnpq.br/6595179051283009 Neiva, Márcia http://lattes.cnpq.br/4524897490719405 Síntese química β-glucosidase Aspergillus niger Pichia pastoris Expressão heteróloga Chemical synthesis Heterologous expression CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: GENÉTICA: GENÉTICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA: BIOLOGIA MOLECULAR As enzimas celulolíticas são produzidas por uma diversidade de microrganismos. Contudo, a grande maioria apresenta grandes restrições que dificultam ou que oneram o processo de produção das enzimas. Além disso, grande parte dos consórcios enzimáticos comerciais disponíveis, apesar de apresentarem os três grupos de celulases (Endoglucanases, Celobiohidrolase, β-glucosidase) para a completa degradação da celulose, possuem uma baixa atividade β-glucosidásica. Deste modo, gera necessidade de suplementação desta enzima a estes preparados enzimáticos. Para resolver estas restrições, a biologia molecular aliada à tecnologia do DNA recombinante se configura como uma ferramenta favorável na produção enzimática, viabilizando a expressão apenas das enzimas de interesse, minimizando ou eliminando a produção de proteínas interferentes. Neste contexto, a produção de β-glucosidase recombinante por microrganismo geneticamente modificado Pichia pastoris, se configura como um grande passo para obtenção dessa enzima com uma produção economicamente viável e com grande potencial para aplicação na industrial. Portanto, β-glucosidases recombinantes são potenciais ferramentas na produção de bioetanol, e no futuro próximo, pode ser bem-sucedida no cumprimento dos requisitos de fontes alternativas e renováveis de energia. De acordo com a crescente importância da β-glucosidase em diversas aplicações, o presente trabalho teve como objetivo clonar e expressar a enzima β-glucosidase recombinante de Aspergillus niger na levedura metilotrófica P. pastoris. Conforme os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima β-glucosidase de A. niger foi expressa eficientemente na levedura P. pastoris, assim como, a sua secreção no sobrenadante da cultura celular conforme análise de imunodetecção Colony Blotting. Baseado no perfil eletroforético em gel SDS-PAGE dos tempos de indução da produção de β-glucosidase dos clones recombinantes Mut+ (46) e clone Muts (22), a indução em meio liquido dos clones recombinantes foi realizada com sucesso devido à apresentação da banda correspondente a enzima β- glucosidase com massa molecular de aproximadamente 103 kDa. No clone Mut+ o melhor tempo de indução para expressão da proteína recombinante foi o tempo de 72 horas, no clone Muts os melhores tempos foram 72 horas e 96 horas. Portanto, a atividade β-glucosidásica do clone recombinante Muts foi de 12.517,33 U. L-1. Cellulolytic enzymes are produced by a variety of microorganisms. However the great majority have major constraints that hamper or hinder the process of enzyme production. In addition, most of the available commercial enzymatic consortia, although presenting the three groups of cellulases (Endoglucanases, Celobiohidrolase, β-glucosidase) for the complete degradation of the cellulose, have a low β-glucosidásica activity. Thus, it is necessary to supplement this enzyme with these enzyme preparations. To solve these constraints, the molecular biology allied to recombinant DNA technology is configured as a favorable tool in the enzymatic production, allowing the expression of only the enzymes of interest, minimizing or eliminating the production of interfering proteins. In this context, the production of recombinant β-glucosidase by the genetically modified microorganism Pichia pastoris, constitutes a great step to obtain this enzyme with an economically viable production and with great potential for industrial application. Therefore, recombinant β-glucosidases are potential tools in the production of bioethanol, and in the near future, can be successful in meeting the requirements of alternative and renewable energy sources. According to the growing importance of β-glucosidase in several applications, the present work aimed to clone and express the recombinant β-glucosidase enzyme of Aspergillus niger in the methylotrophic yeast P. pastoris. According to the results obtained, it was possible to demonstrate that the enzyme β-glucosidase of A. niger was efficiently expressed in yeast P. pastoris, as well as its secretion in the supernatant of the cell culture according to the analysis of immunodetection Colony Blotting. Based on the SDS-PAGE gel electrophoretic profile of the induction times of the β-glucosidase production of recombinant clones Mut+ (46) and clone Muts (22), the induction in liquid medium of the recombinant clones was successfully performed due to the presentation of the band corresponding to the β-glucosidase enzyme with molecular mass of approximately 103 kDa. In the Mut+ clone the best induction time for expression of the recombinant protein was 72 hours, in the Muts clone the best times were 72 hours and 96 hours. Therefore, the β-glucosidase activity of the recombinant Muts clone was 12,517.33 U. L-1. FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas 2019-02-19T12:52:27Z 2015-06-18 Dissertação RABELO, Sandro Ferreira. Clonagem e expressão da enzima beta-glucosidase recombinante do fungo Aspergillus niger em Pichia pastoris. 2015. 101 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2015. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/6959 por Acesso Aberto application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia |
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TEDE - Universidade Federal do Amazonas |
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As enzimas celulolíticas são produzidas por uma diversidade de microrganismos. Contudo, a grande maioria apresenta grandes restrições que dificultam ou que oneram o processo de produção das enzimas. Além disso, grande parte dos consórcios enzimáticos comerciais disponíveis, apesar de apresentarem os três grupos de celulases (Endoglucanases, Celobiohidrolase, β-glucosidase) para a completa degradação da celulose, possuem uma baixa atividade β-glucosidásica. Deste modo, gera necessidade de suplementação desta enzima a estes preparados enzimáticos. Para resolver estas restrições, a biologia molecular aliada à tecnologia do DNA recombinante se configura como uma ferramenta favorável na produção enzimática, viabilizando a expressão apenas das enzimas de interesse, minimizando ou eliminando a produção de proteínas interferentes. Neste contexto, a produção de β-glucosidase recombinante por microrganismo geneticamente modificado Pichia pastoris, se configura como um grande passo para obtenção dessa enzima com uma produção economicamente viável e com grande potencial para aplicação na industrial. Portanto, β-glucosidases recombinantes são potenciais ferramentas na produção de bioetanol, e no futuro próximo, pode ser bem-sucedida no cumprimento dos requisitos de fontes alternativas e renováveis de energia. De acordo com a crescente importância da β-glucosidase em diversas aplicações, o presente trabalho teve como objetivo clonar e expressar a enzima β-glucosidase recombinante de Aspergillus niger na levedura metilotrófica P. pastoris. Conforme os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima β-glucosidase de A. niger foi expressa eficientemente na levedura P. pastoris, assim como, a sua secreção no sobrenadante da cultura celular conforme análise de imunodetecção Colony Blotting. Baseado no perfil eletroforético em gel SDS-PAGE dos tempos de indução da produção de β-glucosidase dos clones recombinantes Mut+ (46) e clone Muts (22), a indução em meio liquido dos clones recombinantes foi realizada com sucesso devido à apresentação da banda correspondente a enzima β- glucosidase com massa molecular de aproximadamente 103 kDa. No clone Mut+ o melhor tempo de indução para expressão da proteína recombinante foi o tempo de 72 horas, no clone Muts os melhores tempos foram 72 horas e 96 horas. Portanto, a atividade β-glucosidásica do clone recombinante Muts foi de 12.517,33 U. L-1. |
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