Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator

Pinto, Elson Antônio Sadalla; http://lattes.cnpq.br/9786797594989755

Tese

Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator

A expressão heteróloga do hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (rtGH), Colossoma macropomum, na levedura metilotrófica Pichia pastoris aponta a perspectiva de geração de um produto biotecnológico inovador para a piscicultura brasileira, em especial para o cultivo do tambaqui. Nessa persp...

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Autor principal:	Pinto, Elson Antônio Sadalla
Outros Autores:	http://lattes.cnpq.br/9786797594989755
Grau:	Tese
Idioma:	por
Publicado em:	Universidade Federal do Amazonas 2019
Assuntos:	Hormônio de crescimento Tambaqui Expressão heteróloga Frascos agitados Biorreator CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Acesso em linha:	https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7009

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spelling	oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-70092019-08-21T19:39:38Z Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator Pinto, Elson Antônio Sadalla Andrade, Edmar Vaz de http://lattes.cnpq.br/9786797594989755 http://lattes.cnpq.br/4691893433367918 Carmo, Edson Júnior do http://lattes.cnpq.br/5780309549588357 Carvalho, Elen Bethleen de Souza http://lattes.cnpq.br/1223389633924270 Zanotto, Sandra Patricia http://lattes.cnpq.br/9663104101654271 Hormônio de crescimento Tambaqui Expressão heteróloga Frascos agitados Biorreator CIÊNCIAS BIOLÓGICAS A expressão heteróloga do hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (rtGH), Colossoma macropomum, na levedura metilotrófica Pichia pastoris aponta a perspectiva de geração de um produto biotecnológico inovador para a piscicultura brasileira, em especial para o cultivo do tambaqui. Nessa perspectiva, esta pesquisa teve por objetivo avaliar o potencial de expressão do rtGH na levedura P. pastoris, em sistema de frascos agitados e em biorreator. Inicialmente foi realizada uma seleção dos clones transformantes de P. pastoris com capacidade de produzir os melhores níveis de rtGH, levendo em consideração o fenótipo. Para melhorar o nível de expressão do rtGH em sistema de frascos agitados, foram utilizadas as ferramentas estatísticas de planejamento experimental fatorial. Primeiramente, um screening design baseado no delineamento Plackett e Burman foi utilizado para seleção dos parâmetros mais significativos relacionados à produção de rtGH e biomassa: extrato de levedura, peptona, ureia, tampão fosfato, biotina, metanol, inóculo e pH. Posteriormente, os parâmetros selecionados, metanol e peptona, foram avaliados em DCCR e analisados por meio da metodologia de superfície de resposta. Por fim, foi realizada uma fermentação conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol e o perfil cinético de produção do rtGH determinado. Os resultados obtidos indicaram o clone 32b, fenótipo Mut+, como o mais produtivo. O metanol foi apontado como o parâmetro mais importante para a produção do rtGH, seguido da peptona, biotina e inóculo. Em relação à formação de biomassa, o metanol, extrato de levedura e tampão fosfato foram os parâmetros mais importantes. De acordo com o modelo obtido, as concentrações de 1,55 % de metanol e 2,8% de peptona foram consideradas ótimas para produção do rtGH. O modelo foi validado com aumento da produção de rtGH de 0,3 mg/L para 2,4 mg/L na condição otimizada. A fermentação em biorreator, conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol, resultou num nível de produção de rtGH de 250 mg/L, aproximadamente 100 vezes superior ao obtido em frascos agitados. Esta pesquisa foi pioneira no desenvolvimento de estratégias de otimização da produção do rtGH em P. pastoris utilizando frascos agitados e biorreator. The heterologous expression of recombinant growth hormone from tambaqui (rtGH), Colossoma macropomum, in the methylotrophic yeast Pichia pastoris points to the prospect of generating an innovative biotechnological product for Brazilian fish farming, especially for the cultivation of tambaqui. In this perspective, this research aimed to evaluate the potential of rtGH expression in yeast P. pastoris, in shaken flasks and in bioreactor. Initially, a selection of the transforming clones of P. pastoris with the capacity to produce the best rtGH levels was carried out, taking into account the phenotype. In order to improve the level of rtGH expression in the shaken flasks system, the statistical tools of factorial experimental planning were used. First, a screening design based on the Plackett and Burman design was used to select the most significant parameters related to the production of rtGH and biomass: yeast extract, peptone, urea, phosphate buffer, biotin, methanol, inoculum and pH. Subsequently, the selected parameters, methanol and peptone, were evaluated in DCCR and analyzed using the response surface methodology. Finally, a fermentation was carried out in batch fed by pulses of methanol and the kinetic profile of the determined rtGH production. The results indicated clone 32b, Mut+ phenotype, as the most productive. Methanol was identified as the most important parameter for rtGH production, followed by peptone, biotin and inoculum. In relation to biomass formation, methanol, yeast extract and phosphate buffer were the most important parameters. According to the obtained model, the concentrations of 1.55% methanol and 2.8% peptone were considered optimal for rtGH production. The model was validated with increased rtGH production from 0.3 mg / L to 2.4 mg / L in the optimized condition. Bioreactor fermentation conducted in batch pulsed methanol resulted in a rtGH production level of 250 mg / L, approximately 100 times greater than that obtained in shaken flasks. This research pioneered the development of optimization strategies for rtGH production in P. pastoris using shaken flasks and bioreactor. FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas 2019-03-08T18:19:34Z 2018-03-31 Tese SADALLA-PINTO, Elson Antônio. Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator. 2018. 86 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2018. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7009 por Acesso Aberto application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator

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