Uma das principais críticas à metodologia de estudo da atividade antifúngica padronizada pela Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) – protocolo M27-A3 é o custo do meio de crescimento RPMI-1640 e do tampão MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico). Devido à essas limitações, o presente trabalho teve como objetivo investigar a influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol. Para avaliar esse objetivo foram realizados ensaios univariados modificando o ensaio preconizado pela CLSI protocolo M27-A3. Leveduras utilizadas nos ensaios pertenceram aos gêneros Candida e Cryptococcus. As modificações feitas no protocolo M27-A3 foram: a) mudança de meio de cultura (cinco meios foram avaliados: o meio YNB e quatro diferentes variações da composição de Sabouraud); b) tipo de tampão (bicarbonato de sódio, tris-HCL e fosfato), concentração do inóculo (102, 104, 105 células/mL), tempo de incubação (24 e 48 h) e forma de leitura (visual, corante e espectrofotômetro) na concentração inibitória mínima das leveduras frente ao fluconazol. Os diferentes meios de cultivo avaliados (exceto o meio dextrose 2% e peptona de caseína 1%) resultaram em resultados similares de CIM aos ensaios realizados com o meio padrão RPMI. Os ensaios com tampão Tris-HCl resultaram em resultados similares de CIM aos ensaios realizados com o tampão padrão MOPS. A concentração de 1x103 células/mL foi a única concentração testada que resultou em resultados similares ao protocolo padrão. Somente o tempo incubação do ensaio 24hs demonstrou ser adequado para o gênero Candida. A leitura visual direta, visual com uso de corante biológico (resazurina) e por espectrofotometria apresentaram resultados semelhantes. A partir do conhecimento obtido nos experimentos univariados um novo protocolo foi proposto: a) meio de cultivo: dextrose 5 g/L e peptona de soja 10 g/L; b) tampão: Tris-HCL; c) inóculum de 0,5-2,5 x103, d) ensaio de 24 h para Candida spp e 48hs para Cryptococcus neoformans e e) leitura visual direta. A análise de variância demonstrou 95% de regressão comparando-se os resultados da CIM de 19 leveduras submetidas ao antifungigrama pelo protocolo da CLSI e o proposto no presente estudo. Esses resultados são importantes e robustos e apresentam uma opção mais acessível para a realização dos ensaios de antifungigrama. No entanto, se faz necessário um estudo multicêntrico, com um número maior de micro-organismos, para avaliar o efeito do meio nas variações intra e interlaboratoriais nas CIM de fluconazol para as leveduras.
|
