Influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol

Sousa, Edinaira Sulany Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/5610501131837696

Dissertação

Influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol

Uma das principais críticas à metodologia de estudo da atividade antifúngica padronizada pela Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) – protocolo M27-A3 é o custo do meio de crescimento RPMI-1640 e do tampão MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico). Devido à essas limitações, o presente...

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Autor principal:	Sousa, Edinaira Sulany Oliveira de
Outros Autores:	http://lattes.cnpq.br/5610501131837696
Grau:	Dissertação
Idioma:	por
Publicado em:	Universidade Federal do Amazonas 2020
Assuntos:	Leveduras Microdiluição Candida Antifúngicos Fluconazol CIÊNCIAS DA SAÚDE Suscetibilidade Leveduras Microdiluição
Acesso em linha:	https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7639

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spelling	oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-76392020-01-31T05:03:54Z Influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol Sousa, Edinaira Sulany Oliveira de Souza, João Vicente Braga de http://lattes.cnpq.br/5610501131837696 http://lattes.cnpq.br/7804981785557071 Souza, João Vicente Braga de http://lattes.cnpq.br/7804981785557071 Cruz, Kátia Santana http://lattes.cnpq.br/6245928805122624 Kluczkovisk, Ariane Mendonça http://lattes.cnpq.br/0309251615883979 Leveduras Microdiluição Candida Antifúngicos Fluconazol CIÊNCIAS DA SAÚDE Suscetibilidade Leveduras Microdiluição Uma das principais críticas à metodologia de estudo da atividade antifúngica padronizada pela Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) – protocolo M27-A3 é o custo do meio de crescimento RPMI-1640 e do tampão MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico). Devido à essas limitações, o presente trabalho teve como objetivo investigar a influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol. Para avaliar esse objetivo foram realizados ensaios univariados modificando o ensaio preconizado pela CLSI protocolo M27-A3. Leveduras utilizadas nos ensaios pertenceram aos gêneros Candida e Cryptococcus. As modificações feitas no protocolo M27-A3 foram: a) mudança de meio de cultura (cinco meios foram avaliados: o meio YNB e quatro diferentes variações da composição de Sabouraud); b) tipo de tampão (bicarbonato de sódio, tris-HCL e fosfato), concentração do inóculo (102, 104, 105 células/mL), tempo de incubação (24 e 48 h) e forma de leitura (visual, corante e espectrofotômetro) na concentração inibitória mínima das leveduras frente ao fluconazol. Os diferentes meios de cultivo avaliados (exceto o meio dextrose 2% e peptona de caseína 1%) resultaram em resultados similares de CIM aos ensaios realizados com o meio padrão RPMI. Os ensaios com tampão Tris-HCl resultaram em resultados similares de CIM aos ensaios realizados com o tampão padrão MOPS. A concentração de 1x103 células/mL foi a única concentração testada que resultou em resultados similares ao protocolo padrão. Somente o tempo incubação do ensaio 24hs demonstrou ser adequado para o gênero Candida. A leitura visual direta, visual com uso de corante biológico (resazurina) e por espectrofotometria apresentaram resultados semelhantes. A partir do conhecimento obtido nos experimentos univariados um novo protocolo foi proposto: a) meio de cultivo: dextrose 5 g/L e peptona de soja 10 g/L; b) tampão: Tris-HCL; c) inóculum de 0,5-2,5 x103, d) ensaio de 24 h para Candida spp e 48hs para Cryptococcus neoformans e e) leitura visual direta. A análise de variância demonstrou 95% de regressão comparando-se os resultados da CIM de 19 leveduras submetidas ao antifungigrama pelo protocolo da CLSI e o proposto no presente estudo. Esses resultados são importantes e robustos e apresentam uma opção mais acessível para a realização dos ensaios de antifungigrama. No entanto, se faz necessário um estudo multicêntrico, com um número maior de micro-organismos, para avaliar o efeito do meio nas variações intra e interlaboratoriais nas CIM de fluconazol para as leveduras. One of the main criticisms of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) standard protocol for studying antifungal activity - protocol M27-A3 is the cost of the RPMI-1640 growth medium and the MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid) buffer. Due to these limitations, the present study aimed to investigate the influence of modifications in the broth microdilution technique (CLSI, protocol M27-A3) on the determination of fluconazole yeast sensitivity. To evaluate this objective univariate assays were performed modifying the test recommended by CLSI protocol M27-A3. Yeasts used in the trials belonged to Candida and Cryptococcus genera. The modifications made to the M27-A3 protocol were: a) culture media change (five media were evaluated: YNB medium and four different Sabouraud composition variations); b) buffer type (sodium bicarbonate, tris-HCL and phosphate), inoculum concentration (102, 104, 105 cells / mL), incubation time (24 and 48 h) and reading form (visual, dye and spectrophotometer) ) in the MIC of yeast in front of fluconazole. The different culture media evaluated (except 2% dextrose medium and 1% casein peptone) resulted in similar MIC results to assays performed with standard RPMI medium. Tris-HCl buffer assays resulted in similar MIC results to those performed with standard MOPS buffer. The concentration of 1x10 3 cells / mL was the only concentration tested that resulted in results similar to the standard protocol. Only the incubation time of the 24hs trial proved to be suitable for the Candida genus. Direct visual reading, visual dye use (resazurin) and spectrophotometry showed similar results. From the knowledge obtained in the univariate experiments a new protocol was proposed: a) culture medium: dextrose 5 g / L and soybean peptone 10 g / L; b) buffer: Tris-HCL; c) 0.5-2.5 x103 inoculum, d) 24 hr assay for Candida spp and 48h for Cryptococcus neoformans and e) direct visual reading. The analysis of variance showed 95% regression comparing the MIC results of 19 yeasts submitted to antifungigram by CLSI protocol and the one proposed in the present study. These results are important and robust and present a more affordable option for antifungigram assays. However, a multicenter study with a larger number of microorganisms is needed to evaluate the effect of the medium on intra and interlaboratory variations in fluconazole MICs for yeast. 2020-01-30T18:19:30Z 2019-10-23 Dissertação SOUSA, Edinaira Sulany Oliveira de. Influência de modificações na técnica de microdiluição em caldo (CLSI, protocolo M27-A3) na determinação de sensibilidade de leveduras ao fluconazol. 2019. 69 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2019. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7639 por Acesso Aberto http://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/ application/pdf Universidade Federal do Amazonas Faculdade de Ciências Farmacêuticas Brasil UFAM Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
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