malária é considerada um problema de saúde pública global em humanos ao longo de
anos, devido a ser uma das principais doenças com maior impacto na morbidade e
mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Os métodos mais comumente usados
para o diagnóstico da malária são o exame microscópico, testes de diagnóstico rápido e
reação em cadeia da polimerase, ferramentas limitadas pelo conhecimento técnico
envolvido, menor sensibilidade e elevado custo de reagentes e equipamentos. Diante disso,
há necessidade de desenvolver ferramentas que facilitem o diagnóstico de malária, em
específico a espécie Plasmodium. vivax, de forma mais rápida e de simples execução em
postos de atendimento (POC) por agentes de saúde. Os biossensores eletroquímicos inserem-
se no cenário clínico como promissoras alternativas analíticas para o diagnóstico em POC.
Desta forma, os objetivos centrais deste estudo foram o desenvolvimento de um biossensor
eletroquímico baseado no sistema CRISPR/Cas13a, empregando eletrodos impressos de
carbono modificados com estreptavidina (SPCE/STV), além da detecção de amostras
clínicas de P. vivax por meio do ensaio de fluorescência baseado no sistema
CRISPR/Cas13a. A proteína Cas13a foi expressa e purificada e a sequência de crRNA foi
projetada para reconhecer um fragmento do gene pvmdr-1. Para o desenvolvimento do
biossensor eletroquímico, foi projetado um oligonucleotídeo sintético ssDNA/ssRNA com
presença de uma biotina, o qual foi imobilizado na superfície dos SPCE/STV para a posterior
deteção molecular. As medidas eletroquímicas foram conduzidas por voltametria de pulso
diferencial e voltametria cíclica. Como resultado, o teste CRISPR/Cas13a por fluorescência
apresentou um bom desempenho em ambiente clínico. Das 30 amostras positivas, 27
apresentaram resultados positivo com o método, demonstrando uma sensibilidade clínica
considerável. Das 20 amostras negativas analisadas, o método não detectou a presença de 19
delas, demonstrando uma especificidade aceitável. Além disso, o teste forneceu um limite
de detecção de 1,35 pM, apresentando alta sensibilidade. Por sua vez, o biossensor
desenvolvido usando o sistema CRISPR/Cas13a mostrou ser específico para o fragmento
alvo, sendo registradas mudanças na resposta eletroquímica (aumento de corrente) após a
clivagem colateral de Cas13a sobre o oligonucleotídeo imobilizado na superfície do
eletrodo. Por outro lado, na ausência do alvo, o perfil voltamétrico não obteve alteração,
indicando diferenças entre as amostras positivas e negativas. Como resultados promissores
apresentados neste trabalho, os testes moleculares baseados em CRISPR/Cas13a podem
fornecer uma abordagem alternativa para identificar infecções por P. vivax de maneira fácil
e oportuna.
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