Identificação molecular e produção de enzimas celulolíticas por Trichoderma spp
Trichoderma são fungos anamórficos pertencentes à classe dos hifomicetos, também chamados fungos imperfeitos, assexuais ou conidiais e que têm como teleomorfo o gênero Hypocrea. São fungos de vida livre, distribuídos em todo o mundo e encontrados em solos de diversas temperaturas, especialmente n...
| Autor principal: | Melo, Laryssa da Silva |
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| Outros Autores: | http://lattes.cnpq.br/7615478000846457 |
| Grau: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Publicado em: |
Universidade Federal do Amazonas
2015
|
| Assuntos: | |
| Acesso em linha: |
http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/2254 |
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oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-22542016-05-12T17:13:04Z Identificação molecular e produção de enzimas celulolíticas por Trichoderma spp Melo, Laryssa da Silva Hanada, Rogério Eiji http://lattes.cnpq.br/7615478000846457 http://lattes.cnpq.br/6208942675679254 Celulases Trichoderma Região ITS Cellulases Trichoderma ITS region CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Trichoderma são fungos anamórficos pertencentes à classe dos hifomicetos, também chamados fungos imperfeitos, assexuais ou conidiais e que têm como teleomorfo o gênero Hypocrea. São fungos de vida livre, distribuídos em todo o mundo e encontrados em solos de diversas temperaturas, especialmente naqueles que contém matéria orgânica. Geralmente não são considerados importantes patógenos humanos, mas existem alguns relatos indicando patogenicidade ocasional em algumas espécies. Sua fácil manipulação e cultivo in vitro, estabilidade e viabilidade das colônias preservadas, fazem desse gênero um grande alvo para as pesquisas biotecnológicas. Por tais características, foram isolados Trichoderma das plantas Victoria amazonica, Rollinia sp., Murraya paniculata e Strychnos cogens; da madeira Scleronema micranthum, conhecida como cardeiro; de jatobá (Hymenaea courbaril), do solo de cultura de cubiu (Solanum sessiliflorum) e de terra preta de índio, com o objetivo de identificar, pela biologia molecular, em nível de espécie, tais isolados, bem como avaliar sua capacidade de produção de enzimas celulolíticas. Das 30 linhagens obtidas foram realizadas culturas monospóricas, as quais foram preservadas em óleo mineral, método Castellani e em glicerol 10%. A partir da suspensão em glicerol, de cada amostra foi inoculado 10μL em 20mL de BD e cultivado a 26oC, a 100 rpm por 40:00h. Em seguida foi extraído o DNA genômico, deste realizada a PCR específica para as regiões ITS-1 e ITS-2 do DNA ribossômico e posteriormente o sequenciamento. Para a produção de enzimas, os isolados foram previamente cultivados em meio indutor. Foram inoculados 10μL da solução de esporos (Glicerol 10%) em 50mL de solução de Manachini onde o substrato indutor utilizado foi a carboximetilcelulose. Os fungos foram incubados a 27°C, 120 rpm durante 120 horas. A dosagem de CMCase foi efetuada com base no método do Ácido Dinitrosalicílico. Para a dosagem de β-glucosidase foi utilizado o pnitrofenil- β-D-Glucopiranosídeo (pNPG) como substrato para a enzima. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se o reagente concentrado comercial da Bio-RadTM e albumina de soro bovino (ASB), como padrão. O resultado da identificação molecular das primeiras 13 amostras nos revelaram as espécies: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum e T. koningiopsis, com um percentual entre 96 e 99% de identidade e 100% de confiabilidade. Os resultados enzimáticos para CMCase indicaram valores baixos, inferiores a 0,100 U/mL com exceção de T. koningii (MPCe 10 3.2), T. harzianum (MPCe 2 2.2a), ambos isolados de M. paniculata, e o isolado 1437 identificado como Trichoderma sp., proveniente de terra preta de índio, que apresentaram valores um pouco mais altos de 0,112 e 0,103 e 0,105 U/mL, respectivamente. Para β-glucosidase, os resultados apresentados mostraram alta atividade na grande maioria dos isolados com destaque para T. harzianum MPCe 3 3.1(10,45U/mL) e T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9,71 U/mL). Todos os isolados produziram proteínas em meio de cultura contendo carboximetilcelulose como substrato indutor Trichoderma are anamorphic fungi belonging to the class of Hifomicetos, also called imperfect fungi, or asexual conidial and whose gender Hypocrea teleomorph. They are free-living fungi, distributed throughout the world and found in different soil temperatures, especially those containing organic matter. Usually are not considered important human pathogens, but there are some reports indicating occasional pathogenicity of some species. Its easy handling and in vitro, stability and viability of colonies preserved this kind are a big target for biotechnology research. Because of these characteristics were isolated Trichoderma from plant Victoria amazonica, Rollinia sp. Murraya paniculata and Strychnos cogens; wood Scleronema micranthum, known as cardeiro; jatoba (Hymenaea courbaril), land of cubiu culture (Solanum sessiliflorum) and Indian black earth, in order to identify the molecular biology, the species level, such isolates and to assess their ability to produce cellulolytic enzymes. Of the 30 lines obtained were cultured spore, which were preserved in mineral oil, Castellani and method in 10% glycerol. From the suspension in glycerol, each sample was inoculated in 20ml of 10μL BD and cultivated 26oC, 100 rpm for 40:00 h. Next was extracted genomic DNA, performed PCR of specific regions of the ITS-1 and ITS-2 ribosomal DNA sequencing and subsequently. For the production of enzymes, the isolates were first grown in induction medium. Were inoculated 10μL of spore solution (glycerol 10%) in 50 mL of solution Manachini where the substratum was used to carboxymethylcellulose. The fungi were incubated at 27 ° C, 120 rpm for 120 hours. The dosage of CMCase was performed using the method of acid Dinitrosalicílico. For the determination of β-glucosidase was used p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPG) as substrate for the enzyme. The total protein concentration was determined by the Bradford method, using the reagent concentrate commercial Bio-RadTM and bovine serum albumin (ASB) as standard. The result of molecular identification of the first 13 samples revealed the species: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum and T. koningiopsis, with a percentage between 96 and 99% identity and 100% reliability. The results indicated CMCase enzyme to low values, less than 0.100 U / mL with the exception of T. koningii (MPCE 10 3.2), T. harzianum (MPCE 2 2.2a), both isolates of M. paniculata, and isolate 1437 identified as Trichoderma sp., from Indian black earth, which showed slightly higher levels of 0.112 and 0.103 and 0.105 U / mL, respectively. For β-glucosidase, the results showed high activity in the vast majority of isolates with emphasis on T. harzianum MPCE 3 3.1 (10.45 U / mL) and T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9.71 U / mL). All isolates produced protein in culture medium containing carboxymethylcellulose as substrate inducer Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2015-04-11T13:38:51Z 2015-04-07 2009-10-14 Dissertação MELO, Laryssa da Silva. Identificação molecular e produção de enzimas celulolíticas por Trichoderma spp. 2009. 60 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2009. http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/2254 por Acesso Aberto application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas BR UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia |
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TEDE - Universidade Federal do Amazonas |
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em solos de diversas temperaturas, especialmente naqueles que contém matéria
orgânica. Geralmente não são considerados importantes patógenos humanos, mas
existem alguns relatos indicando patogenicidade ocasional em algumas espécies. Sua
fácil manipulação e cultivo in vitro, estabilidade e viabilidade das colônias preservadas,
fazem desse gênero um grande alvo para as pesquisas biotecnológicas. Por tais
características, foram isolados Trichoderma das plantas Victoria amazonica, Rollinia
sp., Murraya paniculata e Strychnos cogens; da madeira Scleronema micranthum,
conhecida como cardeiro; de jatobá (Hymenaea courbaril), do solo de cultura de cubiu
(Solanum sessiliflorum) e de terra preta de índio, com o objetivo de identificar, pela
biologia molecular, em nível de espécie, tais isolados, bem como avaliar sua capacidade
de produção de enzimas celulolíticas. Das 30 linhagens obtidas foram realizadas
culturas monospóricas, as quais foram preservadas em óleo mineral, método Castellani
e em glicerol 10%. A partir da suspensão em glicerol, de cada amostra foi inoculado
10μL em 20mL de BD e cultivado a 26oC, a 100 rpm por 40:00h. Em seguida foi
extraído o DNA genômico, deste realizada a PCR específica para as regiões ITS-1 e
ITS-2 do DNA ribossômico e posteriormente o sequenciamento. Para a produção de
enzimas, os isolados foram previamente cultivados em meio indutor. Foram inoculados
10μL da solução de esporos (Glicerol 10%) em 50mL de solução de Manachini onde o
substrato indutor utilizado foi a carboximetilcelulose. Os fungos foram incubados a
27°C, 120 rpm durante 120 horas. A dosagem de CMCase foi efetuada com base no
método do Ácido Dinitrosalicílico. Para a dosagem de β-glucosidase foi utilizado o pnitrofenil-
β-D-Glucopiranosídeo (pNPG) como substrato para a enzima. A concentração
de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se o reagente
concentrado comercial da Bio-RadTM e albumina de soro bovino (ASB), como padrão.
O resultado da identificação molecular das primeiras 13 amostras nos revelaram as
espécies: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T.
hamatum, T. piluliferum e T. koningiopsis, com um percentual entre 96 e 99% de
identidade e 100% de confiabilidade. Os resultados enzimáticos para CMCase
indicaram valores baixos, inferiores a 0,100 U/mL com exceção de T. koningii (MPCe
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1437 identificado como Trichoderma sp., proveniente de terra preta de índio, que
apresentaram valores um pouco mais altos de 0,112 e 0,103 e 0,105 U/mL,
respectivamente. Para β-glucosidase, os resultados apresentados mostraram alta
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