As arboviroses representam graves problemas de saúde pública no Brasil, particularmente na Região Amazônica. Quatro arboviroses têm-se mostrado especialmente relevantes, a saber: dengue, febre amarela, Oropouche e Mayaro, pois causam doenças humanas graves, com mortalidade relativamente elevada e são responsáveis por surtos epidêmicos. O mapeamento e caracterização dos principais arbovírus registrados no Estado de Rondônia são necessários para identificar quais estão circulando, definir o período de transmissão e seu diagnóstico através de isolamento viral e caracterização molecular pela técnica de RT-PCR,
Isso foi realizado neste estudo com a seleção de primers para a identificação desses vírus tanto isolados a partir do soro do paciente quanto a partir de culturas celulares semeadas com soro dos pacientes.
No presente trabalho, é apresentado resultado de isolamento e caracterização de arbovírus a partir de duzentas e sessenta e seis amostras de sangue coletadas de pacientes com suspeitas de arbovirose nas cidades de Ariquemes, Cacoal, Colorado D Oeste, Jarú, Ouro Preto D Oeste, Porto Velho, Theobroma e Vilhena. As amostras foram inoculadas em culturas de células C6/36 e após sete dias os fluídos celulares foram recolhidos e submetidos à extração de RNA pelo método do TRIzol®. O RNA extraído foi utilizado para RT-PCR com os primers selecionados na literatura especializada. Os primers universais para Flavivirus, Alphavirus, para os quatro sorotipos de dengue, para o sorogrupo Simbu e especifico para febre amarela foram testados nessas amostras. Os amplicons foram submetidos à corrida eletroforética em géis de agarose 1,7% e visualizados em transiluminador ultravioleta. Para o seqüencimento gênico utilizou-se a técnica de interrupção da cadeia por dideoxinucleotídios. Foram utilizados os seqüenciadores ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Biosynthesis, USA), para seqüenciar o vírus dengue sorotipo 1, o Personal Seq 4X4 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o genoma do vírus da dengue sorotipo 3 e o Mega BACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), para seqüenciar o vírus Cacipacoré. Cento e quatorze amostras foram identificadas após a realização da RT-PCR.
Os resultados de isolamento e caracterização das amostras virais foi o seguinte: 70 pacientes com dengue sorotipo 1, um paciente com dengue sorotipo 2; 42 pacientes com dengue sorotipo 3 e um paciente com o vírus Cacipacoré. A seqüência gênica dos vírus da dengue sorotipos 1 e 3 foram analisadas pelo programa Clustal W e apresentaram 98% de semelhança com aqueles isolados em regiões do sudeste do Brasil. Note-se que a amostra isolada de vírus Cacipacoré representa o primeiro isolamento do vírus de seres humanos e seu seqüenciamento apresentou 91% de similaridade com o de amostras isoladas precedentemente de aves migratórias selvagens.
Concluiu-se nestes estudos que a vigilância epidemiológica, associando métodos moleculares e sorológicos de caracterização viral são mais precisos do que aquela feita apenas por técnicas sorológicas. Soma-se a isso o grau de relativa facilidade para se obter o resultado, não sendo uma metodologia que implica em interpretação complexa como a Inibição da Hemaglutinação ou Fixação do Complemento, técnicas que necessitam de amostras pareadas e eventualmente podem fornecer reações cruzadas entre diferentes viroses. Os primers escolhidos tanto para Multiplex-RT-PCR, quanto para Nested-RT-PCR usados neste trabalho, identificam as principais arboviroses circulantes no Estado de Rondônia, e podem ser usados em outros centros de pesquisas na região norte.
Os resultados destes estudos mostram que a agilidade do uso direto do soro de pacientes com suspeitas de arboviroses como fonte de material para a RT-PCR recomendam o uso dessa técnica, pois diminui o tempo na obtenção do resultado.
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