Dissertação

Expressão de fosfatase alcalina em Escherichia coli sob o controle do sistema de regulação do operon lac

A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando...

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Autor principal: Franco, Vanessa Correa
Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/0765176510381097
Grau: Dissertação
Idioma: por
Publicado em: Universidade Federal do Amazonas 2016
Assuntos:
Expressão enzimática
Fosfatase Alcalina
Operon lac
Escherichia coli
sistema de regulação
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Acesso em linha: http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5332
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spelling oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-53322016-12-07T05:03:48Z Expressão de fosfatase alcalina em Escherichia coli sob o controle do sistema de regulação do operon lac Franco, Vanessa Correa Astolfi Filho, Spartaco http://lattes.cnpq.br/0765176510381097 http://lattes.cnpq.br/2699190136695057 Expressão enzimática Fosfatase Alcalina Operon lac Escherichia coli sistema de regulação CIÊNCIAS BIOLÓGICAS A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando-se o gene no plasmídeo pBR322. Posteriormente o gene estrutural phoA foi transferido para o vetor pAC92, derivado do pUC18, onde sua expressão ficou parcialmente regulada, originando o plasmídeo recombinante capaz de programar em E. coli maior nível de expressão. Porém este vetor possui a necessidade do controle da expressão com glicose no meio, do contrário, o excesso da enzima no periplasma causa a morte celular das hospedeiras. Em trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Tecnologias de DNA da UFAM um vetor denominado pULA foi construído a partir da obtenção da região promotora do pAC92, com operador restaurado, clonado em um vetor denominado de pUN, este sendo o pUC18 modificado sem o gene de β–galactosidase e sem sua região promotora/operadora de origem. O presente trabalho descreve a expressão da fosfatase alcalina de E. coli por meio do sistema de expressão regulável do pULA, assim como a purificação desta enzima. Dessa forma, o gene phoA foi subclonado no vetor pULA com sucesso, dando origem ao vetor pUNF, que se apresentou estável e funcional, regulado pela indução do IPTG. A melhor expressão da enzima no sistema em questão, ocorreu em meio com concentração de 0,05% de glicose, com um 1mM de IPTG e após 18 horas de indução. Alkaline phosphatase function is to catalyze the hydrolysis of a phosphomonoester, and thus has the property of removing phosphate groups 5' DNA and RNA, making it an important tool for genetic engineering. Expression of the E. coli alkaline phosphatase gene was obtained by cloning the gene into plasmid pBR322. Subsequently phoA structural gene was transferred to the vector pAC92 derivative of pUC18 where its expression was regulated partly yielding the recombinant plasmid capable of programming in E. coli highest level of expression. But this vector has the need to control the expression with glucose medium, otherwise the excess of the enzyme in the periplasm causes cell death of the host. In work carried out in the Laboratory of Technologies of DNA called a vector UFAM Pula was built from obtaining pAC92 promoter region, restored operator, cloned in a vector called pUN, this being the modified pUC18 lacking the gene for β - galactosidase and without its promoter region / operator of origin. This paper describes the expression of the alkaline phosphatase of E. coli by means of the adjustable jumps expression system and purification of this enzyme. Thus, the phoA gene was subcloned into the vector jumps successfully, yielding the vector pUNF, which appeared stable and functional, regulated by the induction of IPTG. The best expression of the enzyme in the system in question occurred in the middle with a concentration of 0.05 % glucose, with 1 mM IPTG and after 18 hours of induction. CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2016-12-06T14:08:48Z 2014-03-25 Dissertação FRANCO, Vanessa Correa. Expressão de fosfatase alcalina em Escherichia coli sob o controle do sistema de regulação do operon lac. 2014. 73 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2014. http://tede.ufam.edu.br/handle/tede/5332 por Acesso Aberto application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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