Clonagem, expressão e caracterização enzimática de lipase recombinante em Pichia pastoris
As triacilglicerol lipases, (E.C.3.1.1.3), usualmente chamadas de lipases, catalisam reações de ésteres carboxílicos em triacilglicerol formando ácidos graxos livres, possuem a característica de exercer atividade catalítica em meio aquoso de hidrólise. Fora do meio aquoso, ocorrem reações, de esteri...
| Autor principal: | Vieira, Andre da Fonseca |
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| Outros Autores: | http://lattes.cnpq.br/3182024052340161 |
| Grau: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Publicado em: |
Universidade Federal do Amazonas
2019
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| Assuntos: | |
| Acesso em linha: |
https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7314 |
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oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-73142019-08-20T05:03:38Z Clonagem, expressão e caracterização enzimática de lipase recombinante em Pichia pastoris Vieira, Andre da Fonseca Astolfi Filho, Spartaco http://lattes.cnpq.br/3182024052340161 http://lattes.cnpq.br/2699190136695057 Bücker, Augusto http://lattes.cnpq.br/7815389221859721 Pereira Junior, Nei http://lattes.cnpq.br/7992694643607149 Enzimas Fungos CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA: BIOLOGIA MOLECULAR Metageômica P-nitrofenil palmitato Komagataella pastoris As triacilglicerol lipases, (E.C.3.1.1.3), usualmente chamadas de lipases, catalisam reações de ésteres carboxílicos em triacilglicerol formando ácidos graxos livres, possuem a característica de exercer atividade catalítica em meio aquoso de hidrólise. Fora do meio aquoso, ocorrem reações, de esterificação, interesterificação ou transesterificação. Devido ao grande potencial biotecnológico, as enzimas lipolíticas tem ganhado enorme destaque para uso industrial devido ao seu abrangente leque de aplicações, constituindo um dos grupos de maior importância em biocatálise, favosrescendo maior eficácia no processo. Justifica-se o estudo de novas moléculas com alto potencial biotecnológico para suprir novas necessidades do mercado mundial, especialmente as que provém da Amazônia, região ímpar em diversidade biológica. Com o objetivo de caracterizar enzimaticamente uma lipase recombinante expressa em Pichia pastoris, o gene codificador de lipase foi isolado de uma biblioteca metagenômica de terra preta de índio por PCR e integrado no genoma da levedura P. pastoris no vetor de expressão pPIC9. A transformação ocorreu por eletroporação com 10 µg do cassete de expressão linearizado e clones foram selecionados em meio minimo em aminoácidos. A seleção de clones recombinantes ocorreu em BMMY sólido contendo 1% de tributirina em meio BMMY com clones positivos cultivados em fermentação submersa induzida com metanol 0,5% para a produção de lipase. A região estrutural do gene de lipase foi amplifica com aproximadamente 1200 pb. Foram observados halos de degradação aos redores das colônias. Averiguou-se a presença da enzima com 50 kDa no gel de SDS PAGE. A caracterização enzimática foi último passo para verificar as possibilidades biotecnológicas desta lipase por meio de ensaios colorimétricos, que resultou positivamente para atividade enzimática de 50,80 U/mL temperatura ótima de 50°C e pH de 7 sendo o melhor tempo de reação de 5 minutos As triacylglycerol lipases, (E.C.3.1.1.3), are called lipases, they catalyze carboxylic ester reactions to triacylglycerol to form free fatty acids, have a characteristic of catalytic activity in aqueous hydrolysis medium. Outside the aqueous medium, esterification, interesterification or transesterification reactions occur. The potential biotechnological, lipolytic enzymes, and their industrial industry for their global leukopithetic lipopruticent, which in the industrial industry, which must be important in the importance of biocatalysis, favoring greater sale in the process. Justifying the study of new molecules with high biotechnological potential to supply new needs of the world market, especially those coming from the Amazon, the region seems richer in biodiversity. In order to enzymatically characterize a recombinant lipase in Pichia pastoris, the lipase coding gene was isolated from a library. The production of clones in the minimum in amino acids and the clones were detected in medium. Selection of recombinant clones was completed in BMMY containing 1% tributary solids in BMMY medium with positive clones grown in 0.5% methanol-induced submerged fermentation for lipase production. The structural region of the lipase gene was enlarged by 1200 bp. Degrading halos were observed around the colonies. The presence of the 50 kDa enzyme in the SDS PAGE gel was verified. Enzymatic characterization was important to verify the biotechnological possibilities of lipase through colorimetric assays, which were positively activated for enzymatic research of 50.80 U / mL with optimum temperature of 50 ° C and pH of 7 being the best time of 5 minutes CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2019-08-19T12:53:43Z 2019-06-25 Dissertação VIEIRA, Andre da Fonseca. Clonagem, expressão e caracterização enzimática de lipase recombinante em Pichia pastoris. 2019. 87 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2019. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7314 por Acesso Aberto http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia |
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TEDE - Universidade Federal do Amazonas |
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As triacilglicerol lipases, (E.C.3.1.1.3), usualmente chamadas de lipases, catalisam reações de ésteres carboxílicos em triacilglicerol formando ácidos graxos livres, possuem a característica de exercer atividade catalítica em meio aquoso de hidrólise. Fora do meio aquoso, ocorrem reações, de esterificação, interesterificação ou transesterificação. Devido ao grande potencial biotecnológico, as enzimas lipolíticas tem ganhado enorme destaque para uso industrial devido ao seu abrangente leque de aplicações, constituindo um dos grupos de maior importância em biocatálise, favosrescendo maior eficácia no processo. Justifica-se o estudo de novas moléculas com alto potencial biotecnológico para suprir novas necessidades do mercado mundial, especialmente as que provém da Amazônia, região ímpar em diversidade biológica. Com o objetivo de caracterizar enzimaticamente uma lipase recombinante expressa em Pichia pastoris, o gene codificador de lipase foi isolado de uma biblioteca metagenômica de terra preta de índio por PCR e integrado no genoma da levedura P. pastoris no vetor de expressão pPIC9. A transformação ocorreu por eletroporação com 10 µg do cassete de expressão linearizado e clones foram selecionados em meio minimo em aminoácidos. A seleção de clones recombinantes ocorreu em BMMY sólido contendo 1% de tributirina em meio BMMY com clones positivos cultivados em fermentação submersa induzida com metanol 0,5% para a produção de lipase. A região estrutural do gene de lipase foi amplifica com aproximadamente 1200 pb. Foram observados halos de degradação aos redores das colônias. Averiguou-se a presença da enzima com 50 kDa no gel de SDS PAGE. A caracterização enzimática foi último passo para verificar as possibilidades biotecnológicas desta lipase por meio de ensaios colorimétricos, que resultou positivamente para atividade enzimática de 50,80 U/mL temperatura ótima de 50°C e pH de 7 sendo o melhor tempo de reação de 5 minutos |
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