Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de  Plasmodium vivax e vírus Zika

Mota, Daniele Sousa; http://lattes.cnpq.br/6450592239077241; https://orcid.org/0000-0002-7716-3815

Dissertação

Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de Plasmodium vivax e vírus Zika

As doenças infecciosas continuam sendo um grande problema de saúde no mundo, fazendo parte de maneira significativa dos dados de morbimortalidade. O reconhecimento precoce destas enfermidades, através do uso de testes para diagnóstico rápidos e precisos, agilizam o tratamento do paciente, permitindo...

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Autor principal:	Mota, Daniele Sousa
Outros Autores:	http://lattes.cnpq.br/6450592239077241, https://orcid.org/0000-0002-7716-3815
Grau:	Dissertação
Idioma:	por
Publicado em:	Universidade Federal do Amazonas 2020
Assuntos:	Malária Plasmodium vivax Sistema CRISPR-Cas13a Vírus Zika Purificação da proteína recombinante CIENCIAS BIOLÓGICAS Crispr Cas13a Plasmodium vivax Vírus Zika Diagnóstico
Acesso em linha:	https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7705

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spelling	oai:https:--tede.ufam.edu.br-handle-:tede-77052020-03-06T05:03:41Z Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de Plasmodium vivax e vírus Zika Mota, Daniele Sousa Mariúba, Luis André Morais http://lattes.cnpq.br/6450592239077241 http://lattes.cnpq.br/4784959431673419 Costa, Allyson Guimarães http://lattes.cnpq.br/7531662673281014 Tarragô, Andréa Monteiro http://lattes.cnpq.br/4644326589690231 https://orcid.org/0000-0002-7716-3815 Malária Plasmodium vivax Sistema CRISPR-Cas13a Vírus Zika Purificação da proteína recombinante CIENCIAS BIOLÓGICAS Crispr Cas13a Plasmodium vivax Vírus Zika Diagnóstico As doenças infecciosas continuam sendo um grande problema de saúde no mundo, fazendo parte de maneira significativa dos dados de morbimortalidade. O reconhecimento precoce destas enfermidades, através do uso de testes para diagnóstico rápidos e precisos, agilizam o tratamento do paciente, permitindo assim um melhor atendimento clínico. A malária e a febre do vírus Zika (ZIKV) são doenças infecciosas típicas das regiões tropicais do mundo, como a Amazônia brasileira. As ferramentas tradicionais para identificação dessas doenças possuem desvantagens que limitam a detecção, como baixa especificidade e sensibilidade. Logo, a busca de novos métodos capazes de superar estas dificuldades vem sendo almejada por muitos grupos de pesquisa públicos e privados. Neste campo, o sistema CRISPR-Cas vem ganhando destaque nos últimos 5 anos, contribuindo para importantes avanços no desenvolvimento de técnicas para detecção precisa de alvos moleculares. O objetivo geral deste trabalho foi realizar a expressão e purificação da proteína do sistema CRISPR-Cas13a, chamada LwCas13a, assim como validar sua atividade enzimática aplicando ferramentas para o diagnóstico de malária causada por Plasmodium vivax e para Zika vírus. Como resultados, obtivemos com sucesso a expressão e purificação da proteína recombinante LwCas13a, produção de CRISPR RNA (crRNA) e de RNA alvo sintético (ssRNA) específicos para Plasmodium vivax e ZIKV. Quais observamos reatividade da enzima LwCas31a com uma elevação da intensidade de fluorescência à medida que se aumentava as concentrações de ssRNA no sistema. Uma relação inversamente proporcional foi observada quando dsDNA foi utilizado. As amostras clínicas de pacientes infectados com ZIKV apresentaram reatividade positiva utilizando o método descrito. Não foram obtidos resultados satisfatórios para o diagnóstico de malária por P. vivax utilizando as ferramentas produzidas. Trabalhos futuros serão aplicadas as ferramentas produzidas a um N amostral maior de pacientes infectados por ZIKV e novos alvos moleculares que permitam a detecção eficiente Plasmodium vivax utilizando o sistema CRISPR-Cas13a. Infectious diseases remain a major health problem in the world, making a significant part of the morbidity and mortality data. The early recognition of these diseases, through the use of rapid and accurate diagnostic tests, speeds up the treatment of the patient, thus allowing for better clinical care. Malaria and Zika virus fever (ZIKV) are infectious diseases typical of tropical regions of the world, such as the Brazilian Amazon. Traditional tools for identifying these diseases have disadvantages that limit detection, such as low specificity and sensitivity. Therefore, the search for new methods capable of overcoming these difficulties has been pursued by many public and private research groups. In this field, the CRISPR-Cas system has been gaining prominence in the last 5 years, contributing to important advances in the development of techniques for the accurate detection of molecular targets. The general objective of this work was to perform the expression and purification of the protein of the CRISPR-Cas13a system, called LwCas13a, as well as to validate its enzymatic activity using tools for the diagnosis of malaria caused by Plasmodium vivax and for Zika virus. As a result, we successfully obtained the expression and purification of the recombinant protein LwCas13a, production of CRISPR RNA (crRNA) and synthetic target RNA (ssRNA) specific for Plasmodium vivax and ZIKV. Which we observed reactivity of the enzyme LwCas31a with an increase in fluorescence intensity as the ssRNA concentrations in the system increased. An inversely proportional relationship was observed when dsDNA was used. Clinical samples from patients infected with ZIKV showed positive reactivity using the method described. No satisfactory results were obtained for the diagnosis of P. vivax malaria using the tools produced. Future work will apply the tools produced to a larger sample of patients infected by ZIKV and new molecular targets that allow efficient detection of Plasmodium vivax using the CRISPRCas13a system. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq 2020-03-05T15:33:50Z 2020-02-03 Dissertação MOTA, Daniele Sousa. Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de Plasmodium vivax e vírus Zika. 2020. 72 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2020. https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7705 por Acesso Aberto http://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/ application/pdf Universidade Federal do Amazonas Instituto de Ciências Biológicas Brasil UFAM Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
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Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de Plasmodium vivax e vírus Zika

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